本发明公开了一种新城疫、传染性支气管炎两种病毒同胚增殖培养的方法，使鸡新城疫、传染性支气管炎病毒在同胚接种，并且系统性调整了孵化温度、接种日龄、收胚时间和新城疫、传染性支气管炎两种病毒的浓度及比例，达到最优组合，经孵化、冷却、消毒等工序从鸡胚中收取尿囊液抗原。该方法提高了抗原收量，简化了生产步骤，节约了时间和原材料，降低了生产成本，并且操作更为快捷，具有较好的经济效益和社会效益，便于实施和推广应用。
1.一种鸡新城疫、传染性支气管炎病毒同胚增殖的培养方法，其特征在于培养方法及步骤如下：（1）将新城疫毒种LaSota株毒种稀释成10⁶EID₅₀，传染性支气管炎毒株M41株用PBS液稀释成10³EID₅₀，稀释后将两种病毒液以1:1的比例混合;xa0（2）将混合后毒种接种至11日龄易感鸡胚尿囊内，每胚接种尿囊腔0.15ml，接种后用蜡封接种孔和气孔；（3）将接种后鸡胚放到培养箱，在36.5℃下进行孵化；（4）72小时前每24小时照胚一次，72小时后每6小时照胚一次，弃去72h前的死亡胚，留下72-96h时间段的死亡胚和96h的活胚，在2-8℃环境下冷却12h，将冷却的鸡胚取出，放入收胚室，将蛋壳的气室部位用碘酒消毒后，以无菌手术剥去气室部位的蛋壳，将蛋壳膜，用尖头小镊子将绒毛尿囊膜及羊膜撕破，检查胚液是否浑浊或有异物，如果没有则抽取胚液，收集，即得鸡新城疫、传染性支气管炎抗原。技术领域
本发明涉及属于兽用生物制品培育技术领域，具体涉及一种鸡新城疫、传染性支气管炎病毒同胚增殖的培养方法。
背景技术
新城疫(Newcastledisease)是由新城疫病毒(Newcastlediseasexa0virus,NDV)引起一种鸡的急性、高度接触性传染病，常呈败血性经过，以呼吸困难、下痢、神经机能紊乱、粘膜和浆膜出血为主要特征。该病发病急，感染率和死亡率均较高，有时甚至高达100%，给养禽业，尤其是养鸡业造成不可估量的经济损失，因此被我国定为一类传染病，国际兽疫局定为A类传染病。NDV具有血凝性(HA)，NDV囊膜表面纤突上的血凝素能与红细胞表面的受体结合，引起红细胞凝集。NDV可凝集所有两栖类、爬行类、禽类及小鼠、豚鼠的红细胞，但凝集牛、山羊、绵羊、猪、马及人0型血红细胞的能力则随毒株的不同而异。该病毒可在9-11日龄的鸡胚绒毛尿囊膜上和尿囊腔中培养。鸡传染性支气管炎（Avianxa0Infectiousxa0Bronchitis，AIB）是由传染性支气管炎病毒（Infectiousxa0Bronchitisxa0Virus，IBV）引起的一种急性、高度接触传染性呼吸道疾病。该病于1930年在美国北达科塔州首次发现，由Schalk和Hawn（1931）首次报道。Beach和Schalm（1936）通过鸡的交叉免疫研究证明传染性支气管炎病毒与传染性喉气管炎病毒不同，再次证实IBV的滤过性，确定其病原为病毒。呼吸道上皮细胞为IBV原发的和主要的增殖部位，感染的鸡表现为气管啰音、咳嗽、打喷嚏等；但部分毒株也可以在感染鸡的肾脏、输卵管和肠道等组织器官的上皮细胞中复制和增殖，引起输尿管扩张，肾脏肿大、苍白，呈现典型的“花斑肾”，造成感染鸡发生死亡或产蛋母鸡的产蛋量下降以及蛋品质的下降。鸡传染性支气管炎造成的经济损失非常严重，主要包括：饲料报酬下降，增重减少，并发感染引起气囊炎使肉鸡在加工过程中被淘汰，产蛋下降和蛋品质下降等所造成的经济损失往往远远大于由本病直接致死造成的损失，同样可以给养禽业造成重大的经济损失。随着畜禽养殖规模的不断扩大，生物制品行业也得到了迅速发展，尤其是生物技术的不断更新使疫苗产品的种类显著增加，且品种多样，使用疫苗可有效地防止这两种禽病的发生。其中鸡新城疫与传染性支气管炎的二联苗，其效力与单苗基本相同，具有使用简便、接种程序简单等优点，这类多联苗的发展为一种趋势。目前通常制备鸡新城疫与传染性支气管炎疫苗的方法是先分别制备这两种病毒，然后按一定比例混合后制成苗，这样既费时又费力，而且生产成本也较高。因此，针对现有的鸡新城疫与传染性支气管炎分别培养，费时、费力、费材料的现状，我们急需要改进新城疫、传染性支气管炎培养方式，达到一次培养两种抗原的目的。
发明内容
本发明的目的是，针对现有技术的不足进行改进，提出了一种鸡新城疫、传染性支气管炎病毒同胚增殖的培养方法，本发明通过大量实验验证，创造性的发现新城疫、传染性支气管炎两种病毒共存的最佳浓度比例、接胚日龄、孵化温度、和收胚时间，使新城疫、传染性支气管炎两种病毒能够产生最好的共存，在同胚上接种并生产两种病毒。本发明的技术方案是通过如下步骤来实现的：（1）将新城疫毒种LaSota株毒种稀释成10⁶EID₅₀，传染性支气管炎毒株M41株用PBS液稀释成10³EID₅₀，稀释后将两种病毒液以1:1的比例混合。（2）将混合后毒种接种至11日龄易感鸡胚尿囊内，每胚接种尿囊腔0.15ml，接种后用蜡封接种孔和气孔；（3）将接种后鸡胚放到培养箱，在36.5℃下进行孵化；（4）72小时前每24小时照胚一次，72小时后每6小时照胚一次，弃去72h前的死亡胚，留下72-96h时间段的死亡胚和96h的活胚，将活胚在2-8℃环境下冷却12h，将冷却的鸡胚取出，放入收胚室，将蛋壳的气室部位用碘酒消毒后，以无菌手术剥去气室部位的蛋壳，将蛋壳膜，用尖头小镊子将绒毛尿囊膜及羊膜撕破，检查胚液是否浑浊或有异物，如果没有则抽取胚液，收集，即得鸡新城疫、传染性支气管炎抗原。其中新城疫毒种LaSota株和传染性支气管炎毒株M41株由中国兽医药品监察所鉴定保存，LaSota株保藏号为CVCCxa0AV1615；M41株保藏号为CVCCxa0AV1511。xa0本发明所述的技术方案的有益效果为：本发明所述培养方法通过对新城疫、传染性支气管炎种毒的浓度、接胚日龄、孵化温度、和收胚时间等参数进行体系性的调整，使新城疫、传染性支气管炎两种病毒能够产生最佳共存，在同胚上接种并生产两种病毒，提高了抗原收量，简化了生产步骤，节约了时间和原材料，降低了生产成本，并且操作更为快捷，具有较好的经济效益和社会效益，便于实施和推广应用。
具体实施方式
为了使本发明的技术方案更加清楚明白，下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。本发明实施例中，除另有说明外，所有份数和百分比均按体积计算。实施例：同胚增殖鸡新城疫和传染性支气管炎病毒的培养方法本实施例用新城疫毒种LaSota株、传染性支气管炎毒株为M41株购自中国药品生物制品检定所。1、培养方法及步骤（1）将新城疫毒种LaSota株毒种稀释成10⁵EID₅₀、10⁶EID₅₀、10⁷EID₅₀三组，传染性支气管炎毒株M41株稀释成10³EID₅₀、10⁴EID₅₀、10⁵EID₅₀，稀释后将两种病毒液以1:1的比例混合;xa0（2）将混合后毒种接种至9、10、11日龄易感鸡胚尿囊内，每胚接种尿囊腔0.15ml，接种后用蜡封接种孔和气孔；（3）将接种后鸡胚放到培养箱，分别设置36℃、36.5℃、37℃下进行孵化；（4）弃去72h前的死亡胚，收集72、76、80、86、90、96h时间段的死亡胚和活胚，将活胚在2-8℃环境下冷却12h，将冷却的鸡胚取出，放入收胚室内，将蛋壳的气室部位用碘酒消毒后，以无菌手术剥去气室部位的蛋壳，将蛋壳膜，用尖头小镊子将绒毛尿囊膜及羊膜撕破，检查胚液是否浑浊或有异物，如果没有则抽取胚液，收集，即得鸡新城疫、传染性支气管炎抗原。2、毒价判定数据表1xa0新城疫、传染性支气管炎毒株不同的稀释度对病毒毒价的影响 ntent="drawing" img-format="jpg" inline="yes" orientation="portrait" wi="700"/> 由表1中实施数据可知，将新城疫毒种LaSota株毒种稀释成10⁶EID₅₀，传染性支气管炎毒株M41株稀释成10³EID₅₀时，NDV毒价分别为10^8.4EID₅₀、10^8.6EID₅₀、10^8.5EID₅₀、10^8.6EID₅₀、10^8.,5xa0EID₅₀，均大于10^7.0xa0EID₅₀，且大于其他稀释倍数得到的毒价，IBV毒价分别为10^7.2EID₅₀、10^6.8EID₅₀、10^7.0EID₅₀、10^6.7EID₅₀、10^7.0EID₅₀,均大于10^6.0EID₅₀，且大于其他稀释倍数得到的毒价，因此将新城疫毒种LaSota株毒种稀释成10⁶EID₅₀，传染性支气管炎毒株M41株稀释成10³EID₅₀时，效果最好。表2xa0新城疫、传染性支气管炎毒株不同的接种日龄比较 ntent="drawing" img-format="jpg" inline="yes" orientation="portrait" wi="700"/> 由表2中实施数据可知，新城疫毒种LaSota株与传染性支气管炎毒株M41株毒种接种日龄为11d时，抗原收量分别为14.3ml、14.6ml、13.5ml，均远多于其他接种日，NDV毒价分别为10^8.5EID₅₀、10^8.6EID₅₀、10^8.6EID₅₀，均大于10^7.0xa0EID₅₀，且大于其他接种日龄得到的毒价，IBV毒价分别为10^6.8EID₅₀、10^7.0EID₅₀、10^6.8EID₅₀,均大于10^6.0EID₅₀，且大于其他接种日龄得到的毒价，因此将新城疫毒种LaSota株与传染性支气管炎毒株M41株毒种接种日龄为11d时，效果最好。表3xa0新城疫、传染性支气管炎毒株不同的孵化温度比较 ntent="drawing" img-format="jpg" inline="yes" orientation="portrait" wi="700"/> 由表3中实施数据可知，新城疫毒种LaSota株与传染性支气管炎毒株M41株毒种接种后的孵化温度为36.5℃时，NDV毒价分别为10^8.8EID₅₀、10^8.6EID₅₀、10^8.6EID₅₀，均远大于10^7.0xa0EID₅₀，且大于其他孵化温度得到的毒价，IBV毒价分别为10^7.0EID₅₀、10^6.8EID₅₀、10^7.2EID₅₀,均远大于10^6.0EID₅₀，且大于其他孵化温度得到的毒价，因此将新城疫毒种LaSota株与传染性支气管炎毒株M41株毒种接种后的孵化温度设为36.5℃时，效果最好。表4xa0新城疫、传染性支气管炎毒株不同的收胚时间比较 ntent="drawing" img-format="jpg" inline="yes" orientation="portrait" wi="700"/> 由表4中实施数据可知，新城疫毒种LaSota株与传染性支气管炎毒株M41株不同的收胚时间，得到的抗原收量和抗原中NDV毒价和IBV毒价都不一样，当收胚时间为96h时，抗原收量为14.2ml、14.3ml、14.5ml，均远大于其他收胚时间得到的抗原，且NDV毒价分别为10^8.5EID₅₀、10^8.5EID₅₀、10^8.6EID₅₀，均远大于10^7.0xa0EID₅₀，且大于其他收胚时间得到的毒价，IBV毒价分别为10^7.2EID₅₀、10^6.8EID₅₀、10^7.0EID₅₀,均远大于10^6.0EID₅₀，且大于其他收胚时间得到的毒价，因此新城疫毒种LaSota株与传染性支气管炎毒株M41株的收胚时间为96h时，效果最好。综上所述，本发明所述培养方法通过对新城疫、传染性支气管炎种毒的浓度、接胚日龄、孵化温度、和收胚时间等参数进行体系性的调整，使新城疫、传染性支气管炎两种病毒能够产生最佳共存，在同胚上接种并生产两种病毒，大大提高了抗原收量，简化了生产步骤，节约了时间和原材料，降低了生产成本。